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基因治療（gene therapy）是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病，從而達(dá)到治療目的，也就是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源基因插入患者適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因表達(dá)的產(chǎn)物能治療某種疾病。基因治療技術(shù)從1990年開始第1例臨床試驗至今，經(jīng)歷了近30年的發(fā)展，已成為國內(nèi)外藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。對研發(fā)階段的基因治療產(chǎn)品開展質(zhì)量研究，建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是產(chǎn)品安全、有效的重要保證和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)之一。基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制項目包括鑒別、含量、效價、純度、雜質(zhì)和其他常規(guī)檢測項目等。
基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析方法
基因治療是一種新興治療方式，其治療機(jī)制、基因治療載體安全性、臨床試驗安全性的研究積累尚不完善。國內(nèi)關(guān)于基因治療的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范仍不成熟，監(jiān)管體系尚不全面，相關(guān)法規(guī)政策亦根據(jù)行業(yè)的發(fā)展情況持續(xù)調(diào)整。因此，產(chǎn)品質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究是創(chuàng)新基因治療產(chǎn)品研發(fā)中的一個重要內(nèi)容，是決定產(chǎn)品能否進(jìn)入臨床研究以及順利上市的重要環(huán)節(jié)之一。基因治療產(chǎn)品通常由各種病毒或非病毒載體攜帶治療基因組成，不同種類基因治療產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和質(zhì)量屬性差異較大，質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有較大的復(fù)雜性。基因治療產(chǎn)品質(zhì)量控制的項目包括鑒別、含量、效價、純度、雜質(zhì)和其他常規(guī)檢測項目等，針對每個項目，不同類型的產(chǎn)品具有不同的分析方法。
1、鑒別

基因治療藥物的鑒剔試驗常需要從核酸水平和蛋白水平進(jìn)行。核酸水平常采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和核酸序列測定等方法對載體和目的基因進(jìn)行鑒定。在PCR和RT-PCR中，應(yīng)對載體部分、插入基因、缺失片段以及影響表達(dá)的重要部分進(jìn)行鑒定，同時應(yīng)設(shè)置合適的陽性和陰性對照樣品。蛋白水平鑒定常采用的方法有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫印跡，也應(yīng)設(shè)置合理的對照品進(jìn)行比較。病毒顆粒還可進(jìn)一步通過衣殼蛋白、免疫標(biāo)記和表型特征等進(jìn)行鑒別。
2、含量

在以病毒為載體的基因治療產(chǎn)品中，滴度是表示產(chǎn)品含量即病毒數(shù)量的指標(biāo)。病毒滴度分為總顆粒數(shù)、基因組滴度、感染性滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度等不同的類型。總顆粒數(shù)和基因組滴度表示病毒的物理數(shù)量，為物理滴度；感染性滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度表示有生物活性病毒的數(shù)量，為生物滴度。非病毒載體的基因治療產(chǎn)品的含量通常是指其中的質(zhì)粒DNA含量。常用的檢測方法有：紫外吸收法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、透射電子顯微鏡（TEM）、高效液相色譜（HPLC）法、血凝試驗、定量PCR（qPCR）、DNA斑點(diǎn)雜交、數(shù)字PCR、 噬斑（PFU）法和半數(shù)組織細(xì)胞感染量法等。

3、效價


根據(jù)產(chǎn)品具體情況，應(yīng)建立至少1個反映產(chǎn)品的生理和/或藥理作用模式的生物效價指標(biāo)。效價測定通常包括對表達(dá)基因的功能、目的基因表達(dá)量/表達(dá)效率、溶瘤活性和腫瘤選擇性的測定等。應(yīng)在研究產(chǎn)品的量效關(guān)系基礎(chǔ)上，盡可能開發(fā)定量檢測的方法，并建立適當(dāng)?shù)男r測定參考標(biāo)準(zhǔn)品，將待測樣品與之相比較后計算效價。常用的指標(biāo)有表達(dá)基因的功能測定、目的基因表達(dá)量 / 表達(dá)效率測定以及溶瘤活性和腫瘤選擇性測定。


4、純度和雜質(zhì)


基因治療產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)是在制造和儲存期間形成的具有與所需產(chǎn)物不同活性、功效和安全性的分子變異體，包括空殼等包裝缺陷的病毒或顆粒、聚集體、降解產(chǎn)物以及非超螺旋形式的質(zhì)粒DNA等。殘余的宿主細(xì)胞DNA的檢測常采用DNA雜交、PicoGreen 染色和定量PCR等方法。對于基因治療產(chǎn)品，如果基因載體和宿主細(xì)胞DNA有同源的序列，可能會對DNA雜交法檢測宿主細(xì)胞DNA造成干擾，建議使用特異性更好的定量PCR法。對于慢病毒、仙臺病毒等RNA病毒載體，采用對DNA特異染色的PicoGreen染色法，實(shí)驗操作更為簡便、快速。殘留宿主細(xì)胞蛋白或來自細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白可以通過ELISA、SDS-PAGE分析和/或免疫印跡法進(jìn)行檢測。空殼病毒等可通過電鏡、HPLC、分析超速離心、電荷檢測質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行檢測。


5、復(fù)制型病毒或野生型病毒


對于復(fù)制缺陷型病毒載體，在生產(chǎn)中可能發(fā)生經(jīng)缺失改造的載體與野生型病毒序列之間的同源重組，導(dǎo)致產(chǎn)生復(fù)制型病毒。終產(chǎn)品中復(fù)制型病毒的存在則可能引起病人的不良反應(yīng)，構(gòu)成臨床上的隱患和潛在危險。因此，對于這類產(chǎn)品的復(fù)制型病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目。采用的分析方法可以是感染相應(yīng)細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng)后，基于細(xì)胞病變的方法，或者PCR法、定量PCR法。在一定情況下也可直接采用PCR法或定量PCR法檢測，但這時檢測的是復(fù)制型病毒的核酸片段，不一定為活性病毒，因而可造成假陽性結(jié)果。不管采用何種方法，都需要驗證其檢測下限，并且每次實(shí)驗應(yīng)包含加標(biāo)對照（spike controls）以保證靈敏度達(dá)到要求。

另外，常規(guī)理化檢測項目和常規(guī)安全性檢測項目（例如：外觀、pH、裝量、可見異物、不溶性微粒、滲透壓、輔料含量、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查/熱原檢查和異常毒性檢查、支原體檢查等項目）也需要符合相應(yīng)的規(guī)定。從而保證這些產(chǎn)品安全、有效和質(zhì)量可控，保證人民健康水平的提高。

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