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小分子肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種生化物質(zhì)，是多個氨基酸聚合而成的短鏈，與蛋白質(zhì)之間一直未有明確界限。多肽的制備方法主要有天然提取，化學(xué)合成，基因工程，和生物重組法等，結(jié)構(gòu)相對簡單的多肽較常用化學(xué)合成的方法制備獲得，是多肽藥物的主要制備方式。而在多肽藥物的研發(fā)中，由于多肽的諸多特點，造成了其在分析過程中的難點和挑戰(zhàn)。針對多肽類藥物生物分析的挑戰(zhàn)與對策展開了討論和分享，本文章對此進行了總結(jié)。


與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物和蛋白質(zhì)類似藥物相比，多肽藥物具有活性顯著，特異性較強，與受體的親和性好，毒性較弱且不易在體內(nèi)蓄積；與蛋白類大分子藥物相比，除了多肽疫苗外，多肽類藥物免疫原性相對較小，用藥劑量少，單位活性更高，易于合成、改造和優(yōu)化，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控，能夠迅速確定藥用價值。


近幾年，全球多肽藥物市場整體處于發(fā)展上升期，市場規(guī)模復(fù)合增速達12%以上，市場規(guī)模達到280多億美元。因為多肽在機體內(nèi)扮演的角色多種多樣，參與眾多生理功能，所以多肽藥物的發(fā)展前景不可 ** 。


據(jù)不完全統(tǒng)計，有約500多個多肽產(chǎn)品在全球進入開發(fā)階段，約73種多肽產(chǎn)品，在美國和其它國家獲批，150多種多肽在臨床階段，近一半在臨床二期，每年陸陸續(xù)續(xù)都有新的多肽藥物獲批，近三年獲美國FDA獲批的多肽藥物參見下表：


獲美國FDA獲批的多肽藥物


在80年代早期所研發(fā)的多肽長度大多不超過10個氨基酸，現(xiàn)在近幾十年內(nèi)有所增加，趨向于40個氨基酸甚至更長。2019年口服索馬魯肽在美國FDA獲批轟動業(yè)內(nèi)，因為長度較大的多肽類藥物，想要實現(xiàn)口服、腸道吸收就必須面臨腸道中多種肽酶降解的挑戰(zhàn)，口服索瑪魯肽的獲批無疑為業(yè)界在新劑型的多肽藥物的開發(fā)方面起到了里程碑意義的示范作用。未來多肽藥物的研發(fā)除了基于劑型的改變和優(yōu)化，新的多肽藥物遞送方式、半衰期被延長的修飾化或融合多肽藥物將推動此類藥物分子的發(fā)展。此外，腫瘤抗原肽的開發(fā)也成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的一大熱點。


多肽類分子作為藥物亦有其弊端：多肽類藥物半衰期短，會被機體快速消除，為了達到有效濃度可能需要頻繁給藥，成本較高且給患者造成較大的生活負擔(dān)；穩(wěn)定性差，容易被酶解，甚至對酸、堿、高溫或有機溶劑等敏感而容易失活等。


一、多肽類藥物生物分析面臨的難點與挑戰(zhàn)
多肽的生物分析主要包括PK藥代動力學(xué)試驗，TK毒代動力學(xué)試驗以及抗藥抗體ADA試驗。分析所用到的方法主要包括LC-MS/MS和LBA配體受體結(jié)合試驗。在多肽藥物的分析方法建立中，正是由于多肽的種種特征，造成了其生物分析的挑戰(zhàn)和難點，主要表現(xiàn)在以下幾方面：


（1）分子量小、半衰期短


檢測多肽的關(guān)鍵試劑是抗體。而多肽的分子量小，結(jié)構(gòu)不是很復(fù)雜，使得多肽表位數(shù)目有限，往往具有類半抗原的性質(zhì)，抗體難以產(chǎn)生或效價極低，這都為生物分析關(guān)鍵性試劑抗體的制備帶來很大的挑戰(zhàn)。由于多肽的半衰期短，在機體中往往表現(xiàn)為快速消除，因此生物分析方法的靈敏度和檢測下限有了更高的要求。


（2）給藥方式與給藥劑量


在眾多的給藥方式中，靜脈給藥是生物利用度較高的，而許多較長的多肽類藥物在血液中的半衰期一般很短，靜脈注射后很快就被清除或降解。非靜脈給藥的方式生物利用度低給生物分析提出了挑戰(zhàn)。如許多激素類藥物多為皮下給藥，且藥劑量偏低，因此需要檢測方法更加靈敏，更低的檢測下限。


（3）內(nèi)源性對應(yīng)物的干擾


在對有內(nèi)源性對應(yīng)物的多肽分子建立分析方法時，我們需要特異性非常高的抗體試劑才能夠區(qū)分出內(nèi)源性和外源性的分子，這就給抗體的制備帶來了很大的挑戰(zhàn)。同時，由于多肽的內(nèi)源性對應(yīng)物在體內(nèi)是動態(tài)變化的，因此能夠區(qū)分并排除內(nèi)源性分子干擾分析方法是很必要的。


（4）穩(wěn)定性的影響


多肽類產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題是在生物分析方法開發(fā)中常見的問題，尤其是一些缺乏修飾基團或多肽兩端缺乏保護性基團的肽類分子。許多分子在高溫、凍存、震蕩或酸堿條件下，脆弱敏感，甚至降解或構(gòu)象變化為生物分析方法各種細節(jié)性的質(zhì)量控制等都帶來挑戰(zhàn)。


二、多肽藥物生物分析的應(yīng)對策略
針對分子量小，難以制備特異性的高效價抗體的挑戰(zhàn)，我們可以采取利用大分子抗原作為載體與多肽進行偶聯(lián)的免疫策略，并嘗試不同的免疫佐劑來激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。必要時也可考慮多肽抗原的同源串聯(lián)重組表達；免疫時盡可能選擇與多肽分子同源性相距遠的動物種屬免疫。


對于多肽分子的內(nèi)源性對應(yīng)物的干擾，早做準(zhǔn)備，為具有優(yōu)質(zhì)選擇性的抗體制備提供充足時間，從而構(gòu)建一個非常特異的針對外源性藥物分子的方法，必要時盡可能采用對內(nèi)、外源性分子分別開發(fā)方法以計算扣除內(nèi)源性分子；也可以結(jié)合對所分析的藥物和內(nèi)源性對應(yīng)物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上差異點的認識，針對性采取策略消除內(nèi)源性分子。


針對多肽分子穩(wěn)定性差、易降解的挑戰(zhàn)，有以下方法進行應(yīng)對，如采樣時，選擇好抗凝劑或酶抑制劑防范藥物降解，利用玻璃管或添加不同的表面活性劑防止多肽的吸附或聚集等。在分析實踐中用于配制工作液或儲備液的各緩沖液配方很重要，生物技術(shù)藥物分析部門有好多基于經(jīng)驗的試劑配方，可以在實踐中供大家合作試用。


提高方法的靈敏度可以基于不同的技術(shù)平臺來開發(fā)方法，一般來說，電化學(xué)發(fā)光法比化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光比熒光，熒光比普通可見光吸收法更容易實現(xiàn)較高的靈敏度。基于不同的信號模式，選用不同的分子標(biāo)記方式。同樣的試劑材料，基于不同的Assay For ** t改變也可以改善靈敏度。另外基于底物的變化和信號放大系統(tǒng)的應(yīng)用或組合應(yīng)用也可以實現(xiàn)靈敏度的提高。

檢測平臺的優(yōu)勢并非絕對，基于經(jīng)驗和原理將不同策略組合運用尤為重要。在多肽類生物技術(shù)藥物分析上，生物技術(shù)藥物分析部科靈活運用ELISA, ECL, TRFIA, CLIA, IF, IP, CoIP, qPCR, FACS, ELISpot, 酶學(xué)等多種方法，支持*生物藥如蛋白、抗體（單抗、雙或多特異性抗體、抗體片段）、ADC、多肽、核酸、疫苗及細胞基因治療等藥物在早期開發(fā)、臨床前和臨床階段的PK/TK/Immunogenicity(Total ADA& Nab)/Bio ** rker&Cytokine等研究評價。目前已經(jīng)支持了多個涉及Her2, Trop2, Muc1等靶點的ADC藥物，和EGFR,PCSK9, IL-17A, IL-6, IL-23, VEGF, CD47, TNF-α, CD20，TIGIT等熱門靶點及4-1BB, PD1, PDL-1, CTLA4等免疫檢查點的單抗或多抗藥物，針對CD19類的CAR-T，還有各類融合蛋白、核酸以及眾多涉及糖尿病、心血管、骨、腫瘤等相關(guān)疾病的多肽類藥物不同階段的研究工作。

關(guān)鍵詞：  多肽類藥物質(zhì)量分析  重金屬量檢測  實驗動物疾病模型機構(gòu)  除病毒測試  生物分解能力檢測  功能性評價報告